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1.項(xiàng)目名稱： SOD的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎非臨床藥效學(xué)研究
2.標(biāo)的技術(shù)的內(nèi)容、技術(shù)指標(biāo)和參數(shù)：見附件“SOD的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎非臨床藥效學(xué)研究”實(shí)驗(yàn)方案。
3.項(xiàng)目期限：項(xiàng)目開始時(shí)間預(yù)計(jì)為2022年5月，具體時(shí)間以雙方簽訂合同生效后為準(zhǔn)，合作期限預(yù)計(jì)為一個(gè)月。
4.付款方式：按工作進(jìn)度分兩期支付。
4.1合同簽訂生效后，30日內(nèi)支付40%。
4.2完成SOD的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎非臨床藥效學(xué)研究并出具報(bào)告后，10日內(nèi)支付60%。
5.報(bào)價(jià)規(guī)定及投標(biāo)資質(zhì)：
5.1本項(xiàng)目投標(biāo)報(bào)價(jià)需包括以下內(nèi)容：
5.1.1根據(jù)招標(biāo)文件說明所包括的一切研究項(xiàng)目內(nèi)容。
5.1.2在合同實(shí)施期間因國家有關(guān)政策調(diào)整所可能需要的額外調(diào)整因素。
5.1.3參加議標(biāo)編制投標(biāo)報(bào)價(jià)所涉及的一切費(fèi)用。
5.1.4如有優(yōu)惠項(xiàng)目請明確說明，重大缺漏項(xiàng)目按廢標(biāo)處理。
5.2報(bào)價(jià)為含稅價(jià)，要求開具增值稅普通發(fā)票。
5.3本次招標(biāo)采取一次性報(bào)價(jià)方式，并設(shè)置最高限價(jià)10萬元，總報(bào)價(jià)超過10萬元的按廢標(biāo)處理。
5.4投標(biāo)機(jī)構(gòu)應(yīng)通過國家藥物GLP認(rèn)證。
6.評標(biāo)辦法：
6.1滿足招標(biāo)文件要求，以總價(jià)最低確定中標(biāo)候選人。但如有故意壓低價(jià)格的行為，或出現(xiàn)重大錯(cuò)漏報(bào)，將作為廢標(biāo)處理。
6.2本次招標(biāo)不存在按投標(biāo)報(bào)價(jià)由低到高的排序遞補(bǔ)中標(biāo)候選人的情況。若中標(biāo)候選人放棄中標(biāo)，則擇機(jī)另行安排。
7.開標(biāo)時(shí)間、地點(diǎn)及參與方式：
7.1開標(biāo)時(shí)間及地點(diǎn)：2022年2月28日在漳州水仙藥業(yè)股份有限公司會議室公開開標(biāo)。
7.2參與方式：投標(biāo)人應(yīng)于投標(biāo)截止時(shí)間前以現(xiàn)場遞交或郵寄方式參與投標(biāo)，地址為：福建省漳州市薌城區(qū)南山路1號，漳州水仙藥業(yè)股份有限公司六樓招標(biāo)辦，收件人：游志成，電話：13779911798。以郵寄投標(biāo)文件方式參與投標(biāo)的，快遞單上須注明投標(biāo)單位名稱和參與的招標(biāo)項(xiàng)目編號及項(xiàng)目名稱。開標(biāo)之前為確保寄達(dá)，請事先與我司招標(biāo)辦確認(rèn)。投標(biāo)截止時(shí)間：2022年2月25日17:30，逾期招標(biāo)人有權(quán)拒收。
8.投標(biāo)文件要求：
投標(biāo)文件分成三部分，每部分應(yīng)分開密封裝訂：第一部分為資格文件，第二部分技術(shù)文件，第三部分為商務(wù)文件。
8.1資格文件編制一式一份，主要內(nèi)容為詳細(xì)的投標(biāo)人資料，包括a.三證合一的《營業(yè)執(zhí)照》；b.非法人代表到現(xiàn)場投標(biāo)的需提供法人代表授權(quán)書；c.招標(biāo)文件對投標(biāo)人資格要求的其他資料。
8.2技術(shù)文件編制一式二份，包括技術(shù)開發(fā)內(nèi)容、技術(shù)參數(shù)、完成時(shí)間，招標(biāo)文件要求提供的其它技術(shù)方面的文件，等等。
8.3商務(wù)文件編制一式一份，包括以下內(nèi)容：投標(biāo)報(bào)價(jià)表（必須由法人代表或被授權(quán)人簽字蓋章）、商務(wù)偏離表（如付款方式等，未說明即默認(rèn)響應(yīng)本招標(biāo)文件要求），等等。
8.4除投標(biāo)報(bào)價(jià)書外，其他任何地方不得出現(xiàn)相關(guān)投標(biāo)標(biāo)價(jià)的任何內(nèi)容。
9其他：
9.1.投標(biāo)費(fèi)用：無論投標(biāo)過程中的作法和結(jié)果如何，投標(biāo)方自行承擔(dān)其所有與參加投標(biāo)有關(guān)的全部費(fèi)用。
9.2.投標(biāo)文件和有關(guān)資料一律不退還。
9.3.投標(biāo)文件和報(bào)價(jià)清單須經(jīng)投標(biāo)方單位蓋章方視為有效。
9.4.出現(xiàn)以下情況者，投標(biāo)方的投標(biāo)文件將作為廢標(biāo)：
9.4.1.不符合我國法律、法規(guī)的投標(biāo)文件。
9.4.2.虛報(bào)、謊報(bào)行為的投標(biāo)。
9.4.3. “關(guān)于資格的聲明函”未提供或提供不全。
9.4.4.對招標(biāo)文件中項(xiàng)目期未作出響應(yīng)、或投標(biāo)文件中項(xiàng)目期不明確、或項(xiàng)目期不能滿足招標(biāo)方要求。
9.4.5.投標(biāo)文件與招標(biāo)文件規(guī)定的技術(shù)要求有嚴(yán)重不符合者。
9.5.解決合同糾紛的方式：雙方協(xié)商解決，協(xié)商不成的，由合同簽訂地人民法院判決。
10.評標(biāo)小組：評標(biāo)小組由水仙藥業(yè)公司有關(guān)部門人員組成。
11.聯(lián)系方式：
招標(biāo)辦 游先生：0596-2302616 / 13779911798
技術(shù)交流 康穎：18811568072
招標(biāo)人：漳州水仙藥業(yè)股份有限公司
2022年2月21日
附件一：
投標(biāo)單位法定代表人授權(quán)書
項(xiàng)目名稱：
日 期：
至： （招標(biāo)單位名稱）
（投標(biāo)單位名稱），中華人民共和國合法企業(yè)，法定地址：
（授權(quán)人姓名）特授權(quán) （被授權(quán)人姓名）代表我公司全權(quán)辦理針對上述項(xiàng)目的投標(biāo)、談判、簽約等具體工作，并簽署全部有關(guān)的文件、協(xié)議及合同。
我公司對被授權(quán)人的簽名負(fù)全部責(zé)任。
在撤銷授權(quán)的書面通知以前，本授權(quán)書一直有效。被授權(quán)人簽署的所有文件（在授權(quán)書有效期內(nèi)簽署的）不因授權(quán)的撤銷而失效。
授權(quán)人簽名： 被授權(quán)人簽名：
職務(wù)： 職務(wù)：
投標(biāo)單位（公章）
“SOD的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎非臨床藥效學(xué)研究”實(shí)驗(yàn)方案
本實(shí)驗(yàn)擬采用兩種化學(xué)造模法：DSS（葡聚糖硫酸鈉）、OXZ（惡唑酮）。陽性對照選用口服給藥的SASP（柳氮磺吡啶），或者直腸給藥的5-ASA（5-氨基水楊酸、美沙拉嗪）。
1. DSS造模條件下口服TAT-SOD對潰瘍性結(jié)腸炎（簡稱UC）大鼠的改善作用
1.1動物實(shí)驗(yàn)
選取SD雄性大鼠至少36只，初始體重約220 g，隨機(jī)分成6組，每組至少6只，分別為模型組、正常組、高、中、低劑量L-TAT-SOD（TAT-SOD脂質(zhì)體）組和陽性對照組。造模期間，正常組自由飲用滅菌水，其余組大鼠連續(xù)7天自由飲用3.0 %（m/V）葡聚糖硫酸鈉（dextra sulfate sodium，DSS），構(gòu)建急性結(jié)腸炎大鼠模型。造模成功后，連續(xù)7天分別給予每只用藥大鼠高、中、低劑量灌胃給藥，所對應(yīng)劑量分別為30000 U/kg、10000 U/kg 及3000 U/kg。實(shí)驗(yàn)分組如下：模型組，全程飲用含3% DSS 滅菌水+灌胃生理鹽水；正常組，全程飲用不含DSS滅菌水+灌胃生理鹽水；L-TAT-SOD組，全程飲用含3% DSS滅菌水+灌胃L-TAT-SOD；陽性對照組，全程飲用含3% DSS滅菌水+灌胃500 mg/kg SASP。
1.2 結(jié)腸損傷評價(jià)（DAI評分）
通過疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評價(jià)大鼠的結(jié)腸損傷情況：每天記錄大鼠體重、排便情況，評分后取平均值得出結(jié)腸炎模型大鼠DAI評分以及其變化趨勢。
表1 DAI評分
|
評分 |
體重下降 |
大便形態(tài) |
血便 |
|
0 |
0 |
正常 |
正常 |
|
1 |
1~5 |
松散 |
隱血陽性 |
|
2 |
5~10 |
||
|
3 |
10~15 |
腹瀉 |
肉眼血便 |
|
4 |
＞15 |
DAI評分的計(jì)算公式為：
DAI=（體重下降+大便形態(tài)+血便）÷ 3。
1.3 結(jié)腸密度的測定
給藥7天后，解剖大鼠腹腔，找到結(jié)腸，位于回盲以下 2 cm處向下取材約10 cm至肛門以上2~3 cm。然后立即稱重、測量長度。注意：取材過程中盡量不要破壞組織的完整性，盡量避免拉扯組織，保證組織的本身長度。
結(jié)腸密度以所取結(jié)腸的重量與長度的比值計(jì)算。
結(jié)腸密度（g/mL）＝組織重量（g）÷ 組織長度（cm）
1.4 結(jié)腸組織的HE染色
取大鼠結(jié)腸組織做固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，再于顯微鏡下觀察。具體步驟見參考文獻(xiàn)[26]。
1.5 血清及結(jié)腸組織樣品制備
從大鼠腹主動脈取血并按照鹽酸羥胺法測血清中酶活與炎癥細(xì)胞因子，具體步驟見試劑盒說明書。
收集血液于1.5mL Ep管中。室溫靜置1h后，以4,000rpm，4℃條件離心15min，吸取上清液血清，做好相應(yīng)標(biāo)記且分裝后置于-80℃冰箱保存，以待后續(xù)促炎細(xì)胞因子與抗氧化指標(biāo)測定，需避免反復(fù)凍融。
10%結(jié)腸組織勻漿上清液的制備：準(zhǔn)確稱取結(jié)腸組織并記錄重量（mg），加入9倍的預(yù)冷生理鹽水（μL），勻漿儀徹底研磨后以3,000rpm，4℃條件離心10min留取上清液，做好相應(yīng)標(biāo)記并分裝后置于-80℃冰箱保存，以待后續(xù)促炎細(xì)胞因子與氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)測定，需避免反復(fù)凍融。
1.6 結(jié)腸緊密連接蛋白IHC
采用免疫組化(Immunohistochemistry, IHC)對結(jié)腸組織的緊密連接蛋白Occludin與ZO-1的表達(dá)量進(jìn)行測定，以1.4步驟制備石蠟切片，其余步驟如下：切片脫蠟后修復(fù)抗原，以3%H2O2孵育后于組化圈內(nèi)進(jìn)行血清封閉，滴加一抗以4℃條件孵育過夜，滴加二抗以室溫條件孵育50min，滴加DAB顯色液使目的蛋白顯現(xiàn)陽性信號，以蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后脫水透明，并以中性樹膠封片后鏡檢，采集IHC切片圖像信息。
IHC切片圖像中目的蛋白呈棕褐色陽性表達(dá)，參照Yang等[248]的方法，利用Image Pro-Plus v.6.0軟件測定積分光密度與組織面積（n=6），二者比值平均光密度作為量化分析結(jié)腸組織切片中目的蛋白表達(dá)的指標(biāo)。
1.7 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定
對已獲得的小鼠血清，采用鹽酸羥胺法測定其SOD酶活，具體操作步驟同南京建成生物工程研究所試劑盒。
對已獲得的組織勻漿上清液，采用BCA試劑盒方法測定其中蛋白質(zhì)含量。對組織勻漿上清液進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋后，采用南京建成試劑盒方法測定六項(xiàng)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)SOD、CAT、MDA、GPx、GSH、GSSG與MPO的含量。
1.8促炎細(xì)胞因子的測定
采用Elabscience ELISA試劑盒方法進(jìn)行測定大鼠血清與組織勻漿上清液中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6與IL-1β的含量。
1.9 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析
采用Excel 2010、SPSS 25和GraphPad Prism 8軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（M±SEM）”進(jìn)行表述，進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）并進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)，以p＜0.05為顯著性差異。
2. OXZ造模條件下口服TAT-SOD對潰瘍性結(jié)腸炎（簡稱UC）大鼠的改善作用
本項(xiàng)造模實(shí)驗(yàn)除造模方法不同外，其它方法參考DSS法。
OXZ 法誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎動物模型的建立*: 大鼠背部皮膚剃毛( 2 cm × 2 cm) ，剃毛處滴3%的OXZ( 溶解于100%乙醇) 0.2 mL，自然風(fēng)干，1 d后重復(fù)1次，5 d后將直徑 2 mm 的無菌聚乙烯管插入大腸約 8 cm， 灌入0.5% OXZ( 溶解于50%乙醇) 0.15 mL，注入后大鼠倒置 1 min， 防止倒流。待清醒后正常喂養(yǎng)， 正常對照組注入生理鹽水［9］。
* 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志 2013 年 12 月第 22 卷第 12 期, DSS、TNBS、OXZ 誘導(dǎo)結(jié)腸炎動物模型的對比。
